På tisdagen stormade 3000 aktivister den regionala regeringens huvudkontor i den östliga provinsstaden Luhansk med 465 000 invånare, som ligger bara 32 kilometer från den ryska gränsen, rapporterar nyhetsbyrån AP.

Polisen som förmodades vakta byggnaden lät folket komma in utan motstånd. Den ukrainska flaggan halades och ersattes av en rysk innan dörrarna slogs upp. Den pro-ryska milisen hade även ockuperat säkerhetstjänstens kontor i Luhansk, enligt nyhetsbyrån AP.

Händelserna ökar ytterligare spänningarna i öst, där rebeller har övertagit stadshus, polisstationer och andra offentliga byggnader i minst tio ukrainska städer.

Säkerhetspersonalens, och polisens ovilja att försvara offentliga byggnader från separatisternas ockupation har varit ett tema i östra Ukraina sedan början av april.

”Det regionala ledarskapet har inte kontroll över sin polisstyrka. Den lokala polisen gjorde ingenting, sade Stanislav Rechynsky, en medhjälpare till inrikesminister Arsen Avakov, med hänvisning till händelserna i Luhansk, enligt Reuters.

Rebellerna grep också åklagarmyndigheten och ett tv-center.

Den separatistiska verksamheten i Luhansk verkar ge de pro-ryska rebellerna kontroll över ytterligare en provinshuvudstad.

Pro-ryska separatister tog även kontroll över statliga byggnader i staden Horlivka med 300 000 invånare, med knappast något motstånd från polisen.

Staden Horlivka med nästan 300 000 invånare ligger strax norr om provinsen Donetsk, där främst rysktalande separatister har deklarerat en ”Folkrepubliken Donetsk” och planerar en folkomröstning om utträde den 11 maj.

En beväpnad enhet från Krim – som leds av en påstådd rysk överste – har också etablerat en de facto militär huvudstad i staden Slavyansk, rapporterar The Guardian.

Att även få kontroll över Luhansk skulle ge separatisterna makten över hela Donbasskolfältet – ett obrutet stråk i ett territorium som ligger i anslutning till Ryssland – där enorma stålsmältverk och tunga anläggningar står för cirka en tredjedel av Ukrainas industriproduktion.

Det ligger också i hjärtat av en region som Putin tidigare i april beskrev som det ”Nya Ryssland”, där han återupplivade en term från tiden då tsarerna erövrade området under 17- och 1800 talet. De flesta som bor i området nu identifierar sig som ukrainare, men talar fortfarande ryska som förstaspråk, enligt Reuters.

USA och EU anklagar Moskva för att styra upproret med avsikt att stycka Ukraina.

”I dag, försöker Ryssland ändra på säkerhetslandskapet i östra och centrala Europa”, sade USA:s utrikesminister John Kerry i ett tal på tisdagen, enligt Reuters.

”Oavsett vilken väg Ryssland väljer, kommer USA och våra allierade att stå samman i försvaret av Ukraina.”

De amerikanska och europeiska tjänstemännen har dock upprepade gånger gjort klart att de inte kommer att vidta några militära insatser.

USA:s president Barack Obama, meddelade om nya sanktioner på måndagen, som han sade är avsedda att ändra på Putins ”kalkyl”.

Putin hotade i sin tur på tisdagen att se över den roll som västerländska företag har i ryska energihandelsöverenskommelser.

”Vi skulle helst inte vilja ta till några åtgärder som svar. Jag hoppas att vi inte kommer att komma till den punkten”, sade Putin till journalister efter ett möte med ledarna i Vitryssland och Kazakstan, skriver Reuters.

Rysslands RTS börsindex steg med 1,23 procent på tisdagen i en lättnad över att de senaste sanktionerna från EU och USA varit blygsamma, rapporterar Reuters.

Regionalt självstyre är en kärnfråga i oroligheterna i östra Ukraina, där rebeller fruktar att regeringen som tog makten efter Victor Janukovitj kommer att undertrycka regionens rysktalande invånare.

I Kiev diskuterade Ukrainas parlament på tisdagen möjligheten att hålla en folkomröstning om huruvida landet ska förbli enat eller bli en lös federation som gör att de olika regionerna får mer makt. Dock har ingen enighet nåtts om hur en sådan folkomröstning skulle kunna formuleras eller när den kan hållas.

Julia Tymosjenko, före detta premiärminister, och en av kandidaterna i det kommande presidentvalet och vars parti dominerar den nya regeringen, talade ut på tisdagen mot en överdriven decentralisering.

”Samtidigt som vi ger auktoritet till lokala förvaltningsorgan, är vi skyldiga – under alla omständigheter – att inte förlora makten över landet”, sade Tymosjenko för lagstiftarna, enligt AP.

Ryssland har samlat tiotusentals trupper i områden nära gränsen till Ukraina, vilket ger en växande oro för att Moskva syftar till att använda oroligheterna i östra Ukraina som en förevändning för en invasion.

Ukraina kommer att hålla ett nytt presidentval den 25 maj.